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游離脂肪酸(FFA)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
FFA 既是脂肪水解的產(chǎn)物,又是脂肪合成的底物。血清中 FFA 的濃度與脂類(lèi)代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)。
測(cè)定原理:
FFA 與銅離子結(jié)合形成脂肪酸銅鹽,并溶于lv仿;利用銅試劑法測(cè)定銅離子含量,即可推算出游離脂肪酸含量。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、一個(gè) 25 mL 玻璃瓶、兩個(gè) 10 mL 玻璃瓶、正庚烷、無(wú)水甲醇、lv仿(三氯甲烷)、無(wú)水乙醇和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體×1 瓶,室溫保存。
試劑二:自備。實(shí)驗(yàn)前1 d,加入9.6 mL正庚烷,0.4 mL無(wú)水甲醇,10 mL lv仿(自備), 蓋緊后混勻,室溫保存。
試劑三:液體×1 瓶,室溫保存。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前在試劑瓶中加入4 mL無(wú)水乙醇,充分溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1 瓶,室溫保存。臨用前加入7.8 mL LV仿充分溶解,即為500µmol/L 的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
樣品中 FFA提取:
1、血液中 FFA 測(cè)定:將所取血液,室溫靜置 1 h 后,于 4 ℃ 離心機(jī) 3 500 rpm 離心 15min, 取上層血清置于-20℃冰箱保存,待測(cè)。
2、組織中 FFA 含量測(cè)定:組織用生理鹽水沖洗干凈后,用吸水紙吸取表面水分,按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,入 1mL 試劑一) 進(jìn)行冰浴勻漿,8000rpm,4℃離心 10min,取上清液,待測(cè)。
3、細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體(mL)為500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一)冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 2 秒,間隔 3秒,總時(shí)間 3min);然后 8000rpm,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定:
蓋緊后充分震蕩混勻(2min),靜置5 min,取上層清液50µL于0.5mLEP管,加入100µL 試劑二,40µL 試劑四,混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板,靜置 15min,于 550nm 光吸收,記為 A 空白管。
蓋緊后充分震蕩混勻(2min),靜置5 min,取上層清液50µL于0.5mLEP管,加入100µL 試
劑二,40µL 試劑四,混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板,靜置 15min,于 550nm 光吸收,記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。
蓋緊后充分震蕩混勻(2min),靜置5 min,取上層清液50µL于0.5mLEP管,加入100µL 試劑二,40µL 試劑四,混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板,靜置 15min,于 550nm 光吸收,記為 A 測(cè)定管。
FFA 含量計(jì)算:
1. 血液中 FFA 含量計(jì)算
FFA(µ mol/L)=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×1 L
=500×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)液:500µmol/L;1 L:指每升樣品。
2. 組織中 FFA 含量計(jì)算
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
FFA(µ mol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ÷Cpr
=0.5×(A測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算
FFA(µ mol/g mass)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷W
=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W
3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
FFA(µ mol/104cell)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 樣總
÷細(xì)胞數(shù)量=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
C 標(biāo)準(zhǔn)液:500µmol/L;1 L:指每升樣品;V 樣總:上清液總體積,1 mL=0.001L;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g。
1. 血液中 FFA 含量計(jì)算
FFA(µ mol/L)=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×1 L
=500×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)液:500µmol/L;1 L:指每升樣品。
2. 組織中 FFA 含量計(jì)算
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
FFA(µ mol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷Cpr
=0.5×(A測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算
FFA(µ mol/g mass)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷W
=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W
3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
FFA(µ mol/104cell)=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 樣總÷細(xì)胞數(shù)量=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
C 標(biāo)準(zhǔn)液:500µmol/L;1 L:指每升樣品;V 樣總:上清液總體積,1 mL=0.001L;Cpr:樣
本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g。
注意事項(xiàng):
1. 試劑四配制應(yīng)盡量晚配,在操作到加入試劑三時(shí),再配制試劑四。
2. 該試劑盒不可用塑料比色皿和 96 孔板測(cè)定,需用玻璃比色皿。