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酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術
一,酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術的原理
由于醋酸纖維膜是由醋酸纖維素組成的,對蛋白質(zhì)分子的移動幾乎無阻力,差不多所有在電場中能泳動的物質(zhì)均能在醋酸纖維膜里自由移動,因此在免疫電泳中,醋酸纖維膜是一優(yōu)良的載體。將酶標記抗體與相應抗原在醋酸纖維膜進行電泳,生成免疫復合物,用酶底物顯色,能大幅度地提高檢測的靈敏度和可靠性。使用酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術(Enzyme-Linked-Cellulosa-Acetate-membrane-Immunoelectropheresis,簡稱ELCAIE),筆者文章公布的檢出量是0.3ng的RMV,其實當時的實驗結果已經(jīng)顯示0.1ng的RMV檢測量。
二,酶標醋酸纖維膜免疫電泳技術的程序(檢測RMV)
1,器材與設備
(1)電泳儀(包括電泳槽);
(2)醋酸纖維膜(10cm×14cm,厚度10dmm;
(3)微量進樣器;
(4)竹鉗。
2,材料與試劑
(1) 以0.2mol/LpH7.2硼酸緩沖液連續(xù)稀釋的RMV溶液(10ng/ml→1×10⒌ng/ml);
(2) HRP標記的RMV免疫的兔IgG(戊二醛一步法交聯(lián));
(3) 洗滌液,每1000ml中有500ml 0.1mol pH8.2巴比妥緩沖液和85g食鹽,其余為蒸餾水;
(4) 底物與供氫體溶液(H2O2和DAB-4HC1);
(5) 0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液。
3,實驗程序
(1) 將醋酸纖維膜用軟鉛筆輕輕劃好點樣線,酶標抗體樣點距膜邊3cm,抗原樣點與酶標抗體樣點對距3cm,兩個樣點橫距1.5cm.
(2) 將上述薄膜浸入0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液中浸濕,取出薄膜,用濾紙吸去表面水分,但不要干燥。
(3) 用微量進樣器點樣,抗體每樣點用酶標抗體液10ul,抗原樣點*點是對照,滴加10ul健青菜蛋白溶液;第二、三、四、五樣點滴加RMV抗原溶液各10ul,濃度分別為1×10⒌ng/ml、1×10⒋ng/ml、1×10⒊ng/ml、100ng/ml;第六、七樣點分別滴加5ul、3ul、,濃度為100ng/ml;第八樣點滴加10ul,濃度為10ng/ml;第九樣點滴加5ul,濃度為10ng/ml.
(4) 點樣完畢,將薄膜置于電泳槽中央棱邊,使其架空,然后用濾紙作鹽橋,電泳緩沖液為0.1mol/L PH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,抗原端接負極。
(5) 待作為鹽橋的濾紙全部濕潤后,接通電源,控制電壓150V,電泳時間1.5h左右。
(6) 電泳完畢,將薄膜浸洗在洗滌中過夜。
(7) 次日將薄膜在清水中漂洗3-5min后取出。
(8) zui后滴加H2O2(0.3%)和DAB-4HC1溶液,各占一半量,幾分鐘內(nèi)就會顯示結果。
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