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禽流感病毒H5/H7/H9型(H5/H7/H9)三重核酸檢測試劑盒 (熒光RT-PCR法)
更新時間:2024-08-16 點擊量:247

流感病毒H5/H7/H9型H5/H7/H9三重核酸檢測試劑盒

(熒光RT-PCR法)

 

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:流感病毒H5/H7/H9H5/H7/H9)三重核酸檢測試劑盒(熒光RT-PCR法)

 

【包裝規(guī)格】50T/盒

 

【預(yù)期用途】

禽流感病毒(AIV)屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科,分甲、乙、丙3個型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類,一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染。甲型流感病毒是依據(jù)病毒表面的血細胞凝集素H)和神經(jīng)氨酸酶N)來命名,其中H有16個亞型,N有9個亞型。本試劑盒適用于檢測標本中的流感病毒H5、H7和H9亞型病毒RNA,適用于流感病毒H5、H7和H9亞型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查

 

【檢驗原理】

本試劑盒用流感病毒H5、H7和H9亞型的特異性基因,分別設(shè)計2特異性引物,分別結(jié)合1條特異性熒光探針,用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對流感病毒H5、H7和H9亞型的RNA進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

 

【試劑組成】

     

規(guī)      

H5/H7/H9酶液

50μL×1管

H5/H7/H9反應(yīng)液

950ul×1管

H5/H7/H9陽性質(zhì)控品

50μL ×1管

陰性質(zhì)控品

50μL ×1管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復(fù)凍融不超過5次,有效期12個月。

 

適用儀器

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷倫MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量PCR檢測儀。

 

【標本采集】

病死或撲殺禽,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活禽,采集1ml血液樣本置于1.5ml滅菌離心管中,或用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,置于1mL 50%甘油生理鹽水中。

 

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復(fù)凍融。

 

使用方法

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1 樣本前處理

每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;棉拭子直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中;血液待血凝后取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。

 

1.2 RNA提取

為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠,建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進行提取,嚴格按照對應(yīng)試劑盒說明書進行操作。

 

2. 試劑配制(試劑準備區(qū))

 

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

H5/H7/H9反應(yīng)液

酶液

用量

19μL

1μL

 

3. 加樣(樣本處理區(qū))

將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

 

4. PCR擴增(核酸擴增區(qū))

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM檢測禽流感病毒H5亞型HEX/VIC檢測禽流感病毒H7亞型,CY5通道檢測禽流感病毒H9亞型,淬滅通道(Quencher Dye)選擇NONE,請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1cycle

50

15min

2

1 cycle

95℃

3min

3

45cycle

95

15sec

55℃

30sec

 

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

 

5.2 結(jié)果判斷

陽性:檢測通道Ct值≤38.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑檢測通道38.0<Ct值<40.0,且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗,重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值<40.0且有典型擴增曲線者為陽性,否則為陰性。

陰性:樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

 

6. 檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;

本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

 

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品:無明顯擴增曲線且無Ct值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤30

以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。

 

8. 性能指標

1)敏感性:內(nèi)控樣本敏感性為100%,綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。

2)特異性:100%。

3)穩(wěn)定性:批內(nèi)及批間差異≤3%。

 

注意事項

所有操作嚴格按照說明書進行;

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完全混勻并短暫離心;

反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

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